一、PCR反應組分

1.模板DNA：

來源(yuan)比(bi)較廣(guang)，用(yong)于復(fu)制的(de)(de)PCR模(mo)板(ban)可以是任(ren)何DNA來源(yuan)，如基因組DNA（gDNA）、互補DNA（cDNA）和質(zhi)粒DNA。不(bu)過，DNA的(de)(de)組成或(huo)復(fu)雜度會影(ying)響PCR擴增(zeng)的(de)(de)最(zui)佳(jia)起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量。例如，在起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量為50μL 的(de)(de)PCR中，只需(xu)0.1–1 ng質(zhi)粒DNA，而gDNA則需(xu)要(yao)5–50ng。最(zui)佳(jia)模(mo)板(ban)起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量還取(qu)決(jue)于所使用(yong)的(de)(de) DNA 聚合(he)酶類型(xing)；經過改造(zao) 的(de)(de)DNA聚合(he)酶對(dui)模(mo)板(ban)的(de)(de)親(qin)和力更強，靈敏度更高，所需(xu)的(de)(de)DNA起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量更少。對(dui)DNA起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量的(de)(de)優化很重要(yao)，因為起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量過高會增(zeng)加發生非特異性擴增(zeng)的(de)(de)風(feng)險，而起(qi)(qi)始(shi)(shi)(shi)量過低會降低得率(lv)。

有時候，PCR實驗(yan)方案會使(shi)用(yong)拷(kao)(kao)貝數表示DNA起始量(liang)，特別是gDNA。拷(kao)(kao)貝數的計算取決于分子的數量(liang)，即DNA起始摩爾(er)量(liang)。用(yong)Avogadro常數（L）和摩爾(er)質量(liang)計算拷(kao)(kao)貝數，公式如下：

拷貝數=L×摩爾(er)數=L×（總質(zhi)量/摩爾(er)質(zhi)量）

特定(ding)DNA鏈的摩爾質(zhi)量取決于其(qi)大(da)小或總堿基數（即(ji)其(qi)長(chang)度(du)和單鏈或雙鏈特性的組合）。

理論上，單拷貝DNA或單個細胞在理想條件下足夠用于PCR擴增。但在實際情況中，特定模板量的擴增效率很大程度上取決于反應組分和反應參數，以及DNA聚合酶的靈敏度。

除了gDNA、cDNA和質粒DNA，可通過再次擴增PCR產物，得到更高的目標DNA得率。盡管未純化的PCR產物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、鹽和副產物等遺留反應成分會對擴增造成不利影響。為了避免這種抑制作用，通常建議在下一輪PCR前用水稀釋反應。如需獲取最佳結果，應在再次擴增前將PCR擴增子進行純化。

模板DNA的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組分，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

2.脫(tuo)氧核苷三磷酸（dNTP）：

四種dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是PCR原料，其(qi)比(bi)例和濃(nong)度(du)(du)與PCR密切相關。dNTP粉呈顆粒狀，如(ru)保(bao)存不(bu)(bu)當(dang)易變性失去(qu)生(sheng)物學(xue)活(huo)性。dNTP溶液呈酸性，使(shi)用(yong)時應用(yong)1M NaOH或(huo)1M Tris配(pei)成高(gao)濃(nong)度(du)(du)后，HCI的(de)緩沖液將其(qi)pH調節到7.0～7.5，小量分(fen)裝，-20℃冰凍(dong)保(bao)存。多次凍(dong)融(rong)會使(shi)dNTP降解。在(zai)(zai)PCR反(fan)應中(zhong)，dNTP應為50～200 μmol/L，尤其(qi)是注意(yi)4種dNTP的(de)濃(nong)度(du)(du)要相等(deng)(等(deng)摩爾配(pei)制)，如(ru)其(qi)中(zhong)任何一種濃(nong)度(du)(du)不(bu)(bu)同于其(qi)它幾種時(偏高(gao)或(huo)偏低(di))，就會引起錯配(pei)。濃(nong)度(du)(du)過(guo)低(di)又會降低(di)PCR產(chan)(chan)物的(de)產(chan)(chan)量。但是，在(zai)(zai)某(mou)些情況下(xia)，如(ru)通過(guo)PCR方(fang)法進(jin)(jin)行(xing)隨(sui)機突變，偶爾也會使(shi)用(yong)濃(nong)度(du)(du)不(bu)(bu)等(deng)的(de)dNTP，以促進(jin)(jin)非校正DNA聚合酶產(chan)(chan)生(sheng)更(geng)多的(de)錯誤堿基(ji)插入(ru)。

dNTP儲(chu)存(cun)液：dNTP溶于pH為7.0的(de)NaOH貯(zhu)存(cun)液中(zhong)，最初的(de)貯(zhu)存(cun)液可稀(xi)釋到(dao)10mol/L，分裝后存(cun)放(fang)在(zai)-20℃冰(bing)箱中(zhong)。dNTP使用濃度在(zai)20～200μmol/L之間。4種dNTP必須等濃度配合以(yi)減少錯配誤差。

dNTP使用濃度：在PCR反應中，使用低dNTP濃度，可減少非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入。在常見的PCR應用中，各種dNTP的常用終濃度通常為0.2mM。一般可根據靶序列的長度和組成來決定最低dNTP濃度。例如在100μl的反應體系中，4種dNTP的濃度為20 μmol/L，可基本滿足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP濃度(每種dNTP濃度為2μmol/L)，能夠高度靈敏地(1/107)擴增ras基因點突變的等位基因。

有時，使用高濃度dNTP也可能也是有益的，特別是在存在高濃度 Mg2+的情況下，因為Mg2+可與dNTP結合，減少可被引入的dNTP量。但同時，當dNTP超過最佳濃度時，會抑制PCR反應。為使DNA聚合酶完成有效擴增，反應中的游離dNTP濃度不得超過 0.010–0.015mM（其估計Km值）。當使用非校正DNA聚合酶時，可通過降低dNTP濃度（0.01–0.05 mM）和成比例減少 Mg2+來提高保真度。

3.Taq DNA聚合酶：

DNA聚(ju)合酶是PCR的(de)重要組(zu)成部分，它們能夠(gou)從(cong)單(dan)鏈DNA模板合成新的(de)互補鏈。所有DNA聚(ju)合酶都具有 5′→ 3′ 聚(ju)合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從(cong)按(an)5'至3’方(fang)向延伸。

早期(qi)的(de)(de)PCR，通常使用來(lai)源于大(da)腸桿菌的(de)(de)DNA聚合(he)酶I上的(de)(de) Klenow片段 來(lai)生成新(xin)的(de)(de)子(zi)鏈。但是(shi)，這(zhe)種(zhong)大(da)腸桿菌酶對熱敏感，易受到變(bian)性階段高溫度的(de)(de)破壞，從而無(wu)法繼續進行退(tui)火和延(yan)伸步(bu)驟。因(yin)此，需要(yao)在全程每個循環的(de)(de)退(tui)火步(bu)驟中重新(xin)補充酶。

熱穩定DNA聚合酶的發現是一項重大進步。它實現了長時間的反應穩定性，為PCR方法的改進提供了無限可能。1976年，從耐熱菌Thermus aquaticus中分離出來的Taq DNA 聚合酶是最有名的熱穩定DNA聚合酶之一 。1988年研究人員首次報道，證明TaqDNA聚合酶能夠在 75℃以上保持活性，從而無需手動加入新鮮的酶即可持續循環擴增，實現了工作流程自動化。此外，與大腸桿菌 DNA聚合酶相比，Taq DNA 聚合酶能夠獲得更長的PCR擴增子，并且具有更高的靈敏度、特異性和得率。也因此，Taq DNA 聚合酶被《科學》雜志評為1989年的“年度分子”。

盡管 Taq DNA聚合酶大大改善了PCR實驗方法，但也表現出一些缺點。例如，Taq DNA 聚合酶在90℃以上的DNA鏈變性溫度中相對不穩定。對于需要更高解離溫度的富含GC和/或具有強二級結構的DNA模板而言，這一問題尤為明顯。同時，Taq DNA 酶還缺乏校正活性，會在擴增期間引入錯誤核苷酸。對于克隆和測序而言，序列的準確性至關重要，所以不能存在含有錯配的PCR擴增子。此外，Taq DNA 聚合酶的易錯配特性使其通常無法穩定擴增長度大于5kb的片段。為克服這些缺點，性能更好的DNA聚合酶不斷被開發出來，使PCR在廣泛的生物學應用中發揮其強大的功能。

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100 ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

4.引物：

PCR引(yin)(yin)物(wu)是(shi)(shi)含(han)有15-30個堿基的合成DNA寡核苷(gan)酸。能夠與模(mo)板DNA中目標區域的側翼序列結(jie)(jie)合（通過(guo)序列互(hu)補）。在PCR反應(ying)期間，DNA聚合酶從 3′端開(kai)始(shi)延伸引(yin)(yin)物(wu)。因此，引(yin)(yin)物(wu)結(jie)(jie)合位點必(bi)須是(shi)(shi)靶標附近所特有的，并(bing)且(qie)與起始(shi)DNA的其它部分序列具有最小的同(tong)源性(xing)(xing)，以確(que)保目的片段的特異性(xing)(xing)擴增。

除了(le)序列同源性(xing)(xing)，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)還必須(xu)考慮到其它相關問題，，以確保PCR擴(kuo)增的(de)(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)(xing)。首先，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)序列的(de)(de)(de)熔解溫(wen)度(du)（Tm）必須(xu)在 55–70℃之間，兩種引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de) Tm相差不超(chao)過 5℃。同樣(yang)重要的(de)(de)(de)是，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)序列不能具(ju)有(you)互(hu)(hu)補(bu)性(xing)(xing)（特(te)別是3’末端(duan)），若兩個引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)互(hu)(hu)補(bu)會促進退(tui)火（即(ji)，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)二聚體），自我(wo)互(hu)(hu)補(bu)會導致自我(wo)配對(dui)（即(ji)，二級結構），或(huo)序列的(de)(de)(de)直接(jie)重復(fu)會導致與模板目標(biao)區(qu)域產生不完全配對(dui)。引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)GC含(han)(han)量(liang)最(zui)好在40-60%之間，均勻的(de)(de)(de)C和(he)G分布能夠避免錯誤(wu)發生。同樣(yang)，為了(le)盡量(liang)減少(shao)非特(te)異(yi)性(xing)(xing)，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)3′端(duan)最(zui)多只(zhi)能含(han)(han)有(you)3個G或(huo)C堿基。另一方面，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)3′端(duan)含(han)(han)有(you)1個C或(huo)G核(he)苷酸有(you)利于引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)錨定(ding)和(he)延伸。

引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板 DNA在體外大量擴增。

長序列引物（如，>50 nt）或堿基經修飾的引物通常需要進行 純化 ，以去除非全長產物和未結合的核苷酸。對于分子克隆和突變等應用，建議將引物進行純化，序列和長度的完整性對于實驗的成功至關重要。

為PCR克隆設計引物時，可在5'末端引入限制性酶切位點、重組序列和啟動子結合位點等延伸的非模板序列。這些延伸序列需進行精心設計，以盡量減小對PCR擴增和下游實驗應用的影響。

在配制PCR反應體系時，引物加入量應在0.1–1μM范圍內。對于含有簡并堿基或用于長片段PCR擴增的引物，常用的引物濃度為0.3–1μM 。通常，建議先使用標準濃度，然后根據需要再進行調整。引物濃度過高容易產生錯配和非特異性擴增。而引物濃度過低可能會導致目的片段的少量擴增或無擴增。

5.鎂離子（Mg2+）：

鎂離子（Mg2+）作為DNA聚合(he)(he)酶(mei)活(huo)性(xing)的(de)輔助因子，有助于(yu)聚合(he)(he)期間(jian)dNTP的(de)結合(he)(he)。酶(mei)活(huo)性(xing)位點處的(de)鎂離子可(ke)催化引物的(de)3′-OH與dNTP的(de)磷(lin)酸基團(tuan)間(jian)形(xing)成(cheng)磷(lin)酸二酯鍵。此外，Mg2+  能夠穩定磷(lin)酸鹽骨(gu)架上(shang)的(de)負(fu)電荷，從而促進引物與DNA模板形(xing)成(cheng)復合(he)(he)物。

通常情況下，Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是，因硫酸鹽在某些情況下有助于確保更穩定和可重現的性能，諸如 Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首選MgSO4。由于鎂離子能夠與dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）結合，因此，通常需要對鎂離子濃度進行優化，以盡量提高PCR得率，并保持其擴增特異性。

在PCR中，標準的 Mg2+ 終濃度范圍為1–4mM，建議優化滴定增量為0.5mM。Mg2+ 濃度過低會降低Taq DNA聚合酶活性，導致PCR產物較少或無PCR產物。另一方面，Mg2+ 濃度過高則會提高引物-模板復合物的穩定性，反應特異性降低，產生非特異性PCR產物，并增加由dNTP錯誤插入導致的復制錯誤。

6.緩沖液：

用(yong)于維持DNA聚合酶(mei)的(de)活性和穩定性。緩(huan)沖液pH通常為8.0-9.5，一般(ban)使(shi)用(yong)Tris-HCl來調節。

對于 Taq DNA 聚合酶，緩沖液的一個常見成分是來自KCl的鉀離子（K+)，其可促進引物的吸附。有時，也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+) 具有去穩定作用，尤其對于錯配引物-模板復合物堿基對之間的弱氫鍵，因此可增強反應特異性。

鉀離(li)子和鎂離(li)子 (K+和 Mg2+) 能夠與(yu)DNA骨(gu)架(jia)上的磷酸基團(tuan) (P–) 結合并穩定雙鏈形成，而(er)銨離(li)子 (NH4+) 能夠與(yu)堿基（N）之間的氫鍵相互作用并破(po)壞(huai)雙鏈形成。

由(you)于 Mg2+ 與(yu)K+具有相似的(de)(de)(de)穩定效應(ying)，因此，當使(shi)用KCl緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)時，MgCl2 的(de)(de)(de)建(jian)議(yi)濃(nong)(nong)度通(tong)常較低(1.5 ± 0.25 mM) ，當使(shi)用(NH4)2SO4 緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)時，MgCl2的(de)(de)(de)建(jian)議(yi)濃(nong)(nong)度通(tong)常較高(gao) (2.0 ± 0.5 mM)。由(you)于NH4+ 與(yu)Mg2+具有拮抗效應(ying)，因此，在各種(zhong) Mg2+ 濃(nong)(nong)度下(xia)，含有(NH4)2SO4 的(de)(de)(de)緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)都(dou)表(biao)現出更高(gao)的(de)(de)(de)引物特異性(xing)。由(you)于最佳的(de)(de)(de)PCR緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)取決于所使(shi)用的(de)(de)(de)DNA聚合酶類型，所以有必要(yao)遵循酶供(gong)應(ying)商的(de)(de)(de)提(ti)供(gong)的(de)(de)(de)緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)建(jian)議(yi)。

在(zai)(zai)某些(xie)情況(kuang)下，可在(zai)(zai)緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)(zhong)加入化學(xue)添加劑(ji)或輔(fu)助(zhu)溶劑(ji)，通過減少(shao)錯配來(lai)提高擴(kuo)增特異性，并通過去除二(er)級結構來(lai)提高擴(kuo)增效率。此外，一(yi)些(xie)DNA聚(ju)合酶還隨附提供(gong)了(le)(le)專為DNA聚(ju)合酶和(he)PCR緩(huan)沖(chong)液(ye)優化的特殊增強劑(ji)。這些(xie)試劑(ji)常用(yong)(yong)(yong)于困難(nan)樣(yang)品，如(ru)富(fu)含GC的模板(ban)。應(ying)注意(yi)，使用(yong)(yong)(yong)化學(xue)添加劑(ji)或輔(fu)助(zhu)溶劑(ji)會影(ying)響引物退(tui)火、模板(ban)變性、 Mg2+ 結合以及(ji)酶活性。同時，它們還會干(gan)擾某些(xie)下游(you)(you)應(ying)用(yong)(yong)(yong)——例如(ru)，基因(yin)芯片實驗中(zhong)(zhong)的非離子(zi)去污劑(ji)。因(yin)此，為了(le)(le)成功進行PCR擴(kuo)增和(he)下游(you)(you)實驗應(ying)用(yong)(yong)(yong)，應(ying)慎重考慮(lv)緩(huan)沖(chong)液(ye)組成成分(fen)。

7.熱循環儀:

熱(re)(re)循(xun)環儀(yi)是(shi)(shi)一(yi)(yi)種(zhong)能(neng)夠為PCR反(fan)應自(zi)動(dong)完成溫度(du)循(xun)環和(he)(he)孵育(yu)的(de)儀(yi)器。在(zai)引入熱(re)(re)循(xun)環儀(yi)之前，PCR反(fan)應是(shi)(shi)一(yi)(yi)個費(fei)時(shi)費(fei)力(li)的(de)過程，需在(zai)不同溫度(du)的(de)水浴之間(jian)轉移樣(yang)品(pin)，并為每(mei)個步驟需要精確定時(shi)。熱(re)(re)循(xun)環儀(yi)和(he)(he) Taq DNA 聚(ju)合酶的(de)發現(xian)，讓PCR的(de)自(zi)動(dong)化成為現(xian)實。第(di)一(yi)(yi)款自(zi)動(dong)化PCR熱(re)(re)循(xun)環儀(yi)是(shi)(shi)在(zai)1985年由PerkinElmer和(he)(he)Cetus以合資方式引入市場的(de)。

二、PCR反應條件

1.變性溫度與時間

模板變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)溫(wen)度(du)是決定PCR反應中雙鏈(lian)DNA解(jie)鏈(lian)的(de)溫(wen)度(du)，達不(bu)到變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)溫(wen)度(du)就不(bu)會(hui)產(chan)生單鏈(lian)DNA模板，PCR也就不(bu)會(hui)啟動。變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)溫(wen)度(du)低則變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)不(bu)完全，DNA雙鏈(lian)會(hui)很(hen)快復性(xing)(xing)(xing)(xing)，因而減少產(chan)量(liang)。變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)溫(wen)度(du)太高，又會(hui)影響酶(mei)的(de)活性(xing)(xing)(xing)(xing)，一般情況下可設為(wei)94℃ 20-30秒，高溫(wen)時間應盡量(liang)縮短，以(yi)保(bao)持耐熱DNA聚合酶(mei)的(de)活力，最(zui)高變(bian)性(xing)(xing)(xing)(xing)溫(wen)度(du)不(bu)宜(yi)超(chao)過95℃。

2.退火溫度與實踐

退(tui)(tui)(tui)火(huo)溫度決(jue)定PCR特(te)異性(xing)與(yu)產量(liang)。溫度高特(te)異性(xing)強，但(dan)過(guo)高則引(yin)(yin)物不能(neng)與(yu)模板牢固結(jie)合(he)，DNA擴增效(xiao)率下降(jiang)；溫度低(di)產量(liang)高，但(dan)過(guo)低(di)可造成引(yin)(yin)物與(yu)模板錯配，非(fei)特(te)異性(xing)產物增加。合(he)適(shi)的退(tui)(tui)(tui)火(huo)溫度一(yi)般(ban)在45-68℃之(zhi)間(jian)。設置特(te)定反(fan)應的最適(shi)退(tui)(tui)(tui)火(huo)溫度，可根據引(yin)(yin)物的（G+C）%含量(liang)進行推測(ce)，一(yi)般(ban)實驗中退(tui)(tui)(tui)火(huo)溫度比擴增引(yin)(yin)物的熔(rong)解(jie)溫度Tm低(di)5℃，退(tui)(tui)(tui)火(huo)時間(jian)一(yi)般(ban)為30-60秒(miao)，足(zu)以使引(yin)(yin)物與(yu)模板之(zhi)間(jian)結(jie)合(he)，沒有必要長時間(jian)退(tui)(tui)(tui)火(huo)。

3.延伸溫度與時間

PCR反應的延(yan)伸(shen)(shen)溫度(du)一般(ban)選擇在70-75℃之間(jian)(jian)，延(yan)伸(shen)(shen)時間(jian)(jian)根據所有(you)聚合酶(mei)擴(kuo)增速度(du)和擴(kuo)增片(pian)(pian)段(duan)大小(xiao)設(she)定(ding)。如同樣(yang)擴(kuo)增2kb片(pian)(pian)段(duan)，若使用Taq酶(mei)只需要(yao)1分(fen)鐘，使用Pfu酶(mei)則應設(she)定(ding)2分(fen)鐘以(yi)上。延(yan)伸(shen)(shen)時間(jian)(jian)過長會導致非特異(yi)性擴(kuo)增帶的出現。時間(jian)(jian)太短則可能得不(bu)到擴(kuo)增產物或得到一些(xie)短的非特異(yi)性片(pian)(pian)段(duan)。

4.循環次數

可(ke)根據模(mo)板DNA的量(liang)，擴增片段的大(da)小和擴增產物的下步應用等因素(su)，設定30-40個循(xun)環。循(xun)環次數(shu)太少，擴增量(liang)不足(zu)，如果循(xun)環次數(shu)太多，錯配幾率會增加，非特(te)異性背(bei)景(jing)嚴(yan)重。所以，在保(bao)證產物得率的前提下，應盡量(liang)減少循(xun)環次數(shu)。